Phát hiện loài Fusarium spp. Gây bệnh thối xương rồng (Cactaceae) bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction

iv

 Ly trích đƣợc DNA tổng số của 12 dòng nấm phân lập đƣợc. Khuếch đại
đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 700 bp nằm trong vùng tef của các dòng nấm (dựa
vào thang ladder).
 Giải trình tự vùng tef của 3 dòng nấm thuộc Fusarium spp. gồm: FC07 – 3,
FC07 – 7, FC07 – 10. Xác định dòng FC07 – 3 và FC07 – 10 là nấm Fusarium
solani. Còn dòng FC07 – 7 đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu.
 Chủng bệnh nấm trên xƣơng rồng khỏe: 7 dòng nấm có khả năng gây bệnh
nặng sau 4 ngày chủng bênh (ở nhiệt độ phòng).































v


MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ ii
TÓM TẮT iii
MỤC LỤC v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ x
DANH SÁCH ĐỒ THỊ x
Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích - yêu cầu 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Yêu cầu 2
1.3 Giới hạn của đề tài 2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Một số đặc tính để phát triển kiểng xƣơng rồng 3
2.2. Phân loại thực vật và giới thiệu về cây xƣơng rồng (Cactaceae) 4
2.2.1. Phân loại thực vật 4
2.2.2. Giới thiệu về cây xƣơng rồng và các cây cùng họ 4
2.2.3. Tình hình sản xuất và phát triển xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí Minh và
trên thế giới 5
2.2.3.1. Tại Tp. Hồ Chí Minh 5
2.2.3.2. Trên thế giới 6
2.2.4. Đặc tính thực vật và điều kiện sinh thái của xƣơng rồng (theo Huỳnh
Văn Thới, 2004) 6
2.2.4.1. Đặc tính thực vật 6
2.4.2.2. Điều kiện sinh thái 10

vi
2.2.5. Bệnh hại trên cây xƣơng rồng 11
2.2.5.1. Bệnh thối gốc xƣơng rồng 11
2.2.5.2. Bệnh đốm than 11
2.2.5.3. Tuyến trùng hại xƣơng rồng 12
2.2.5.4. Rệp sáp hại xƣơng rồng 12
2.3. Sự phân loại, phân bố, phạm vi kí chủ, đặc điểm phát sinh phát triển và
khả năng gây bệnh của nấm Fusarium 12
2.3.1. Sự phân loại 12
2.3.2. Sự phân bố 14
2.3.3. Phạm vi kí chủ 14
2.3.4. Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium 14
2.4. Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp. gây ra và biện pháp phòng trừ 14
2.4.1. Khả năng gây hại 14
2.4.2. Một số biện pháp chủ yếu để phòng trị nấm Fusarium spp. 16
2.4.2.1. Sử dụng cây giống kháng bệnh 16
2.4.2.2. Biện pháp canh tác 16
2.4.2.3. Biện pháp hóa học 17
2.5. Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium 17
2.6. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm 18
2.6.1. Khái niệm 18
2.6.2. Nguyên tắc 19
2.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR 20
2.6.4. Ứng dụng của PCR 22
2.7. Giới thiệu sơ lƣợc về kỹ thuật DNA sequencing 22
2.8. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do nấm Fusarium spp. 22
2.8.1. Trên thế giới 22
2.8.2. Tại Việt Nam 25
2.9. Danh mục một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt nam 26
Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

vii
3.1. Vật liệu thí nghiệm 27
3.1.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu 27
3.1.2. Vật liệu 27
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 29
3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết trên cây xƣơng rồng tại TP. Hồ Chí Minh 29
3.2.2. Phân lập mẫu nấm 29
3.2.3. Tăng sinh khối nấm trên môi trƣờng nhân sinh khối 31
3.2.4. Ly trích DNA tổng số của nấm 32
Quy trình này đƣợc thực hiện dựa trên quy trình của Lee và Taylor. 32
3.2.5. Điện di xem DNA tổng số 32
3.2.6. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng tef các dòng nấm
Fusarium spp. 33
3.2.7. Đọc trình tự sản phẩm PCR 35
3.2.8. Chủng nấm lên cây xƣơng rồng 36
3.2.8.1. Tiến hành chủng bệnh trên xƣơng rồng 36
3.2.8.2. Đánh giá kết quả 36
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
4.1. Tình hình bệnh hại xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh 37
4.2. Các triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng 37
4.2.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều
tra (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007). 39
4.3. Phân lập mẫu nấm 40
4.4. Kết quả ly trích thu DNA tổng số từ các loài nấm Fusarium spp. 41
4.5. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng tef 43
4.6. Kết quả giải trình tự vùng tef 43
4.7. Chủng bệnh trên xƣơng rồng 50
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52
5.1. Kết luận 52
5.2. Đề nghị 53

viii
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
PHỤ LỤC 58



DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR :Polymerase chain reaction.
DNA :Deoxyrybonucleotide acid.
TE :Tris EDTA.
TAE :Tris Acetate EDTA.
dNTP :Deoxynucleotide triphosphate.
Taq :Thermus aquaticus.
UV :Ulta violet.
PGA :Potato glucose agar.
WA :Water agar.
EtBr :Ethidium bromide.
l :micro lít.
g :micro gam.
M :micro gam/ lít.
mM :mili gam/ lít.
ctv :cộng tác viên.
ng :nano gam.
bp :base pair.
rDNA : ribosomal DNA
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism.
Tm : Melting Tempereture.
TEF : Translation elongation factor.
ITS : Internal Transcribed Spacer.

ix
NCBI : National Center for Biotechnology Informatic.



DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1. Hình thái bào tử nấm Fusarium spp. 13
Hình 2.2. Vùng gen tef trên nấm Fusarium
sử dụng trong FUSARIUM-ID 17
Hình 4.1. Xƣơng rồng với triệu chứng thối gốc 38
Hình 4.2. Xƣơng rồng với triệu chứng thối vàng và đen ở gốc 39
Hình 4.3. Xƣơng rồng với triệu chứng thối thân 39
Hình 4.4. Xƣơng rồng cắt dọc
với triệu chứng thối từ lõi ra ngoài 39
Hình 4.5. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bệnh
trên môi trƣờng PGA 42
Hình 4.6. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của nấm 43
Hình 4.7. Sản phẩm PCR khi khuếch đại
bằng cặp primer ef1 và ef2. 44
Hình 4.8. Xƣơng rồng khỏe mạnh trƣớc khi chủng bệnh 51
Hình 4.9. Xƣơng rồng với triệu chứng thối sau khi chủng 51
Hình 4.10. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bị bệnh
sau khi chủng nấm 4 ngày trên môi trƣờng PGA. 52






x



DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy
ở Việt Nam (Đỗ Tấn Dũng, 1996). 26
Bảng3.1. Primer dùng trong phản ứng PCR 33
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR và lƣợng
cần dùng đủ cho một phản ứng 34
Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm,
virus gây ra qua các vƣờn điều tra 40
Bảng 4.2. So sánh phần trăm (%) độ tƣơng đồng
giữa dòng FC07 – 3, FC07 – 7 và FC07-10. 46
Bảng 4.3. So sánh phần trăm độ tƣơng đồng (%) giữa 3 dòng
FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10 với các dòng trên genbank 49

DANH SÁCH ĐỒ THỊ

ĐỒ THỊ TRANG
Đồ thị 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm,
virus gây ra qua các vƣờn điều tra 40






1



Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, do nhu cầu đời sống của con ngƣời đƣợc nâng cao nên vấn đề thƣ
giãn tinh thần ngày càng đƣợc coi trọng. Hiện nay vấn đề chơi cây cảnh trên địa bàn
Tp. Hồ Chí Minh (Tp: thành phố) ngày càng phát triển trong đó có xƣơng rồng.
Xƣơng rồng đang dần đƣợc khẳng định trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh vì chúng
tƣơng đối dễ trồng, giá cả phải chăng, ai cũng có thể chơi và chăm sóc. Xƣơng rồng
dù sống trên sa mạc khô cằn vẫn nở hoa sặc sở, thể hiện một sức sống mãnh liệt. Do
nhu cầu của ngƣời sử dụng thích những loại xƣơng rồng lạ nên nhà vƣờn thƣờng lai
tạo ra các loại cây ghép với sự đa dạng về chủng loại từ đó làm cho bệnh hại xƣơng
rồng cũng phát triển theo. Xƣơng rồng cũng bị rất nhiều mầm bệnh tấn công và hậu
quả của nó là làm cho nhiều loại quí hiếm của ngƣời sƣu tầm giống bị hƣ hại dẫn
đến giảm phẩm chất, bệnh nặng và có thể chết hàng loạt gây thiệt hại cho nhà vƣờn
và ngƣời sử dụng. Các bệnh thƣờng gặp trên xƣơng rồng: bệnh thối gốc, bệnh đốm
than… và một trong những bệnh phổ biến nhất là bệnh thối do nấm Fusarium spp.,
bệnh này gây nguy hiểm cho tất cả các loại xƣơng rồng.
Vì vậy, vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác tác nhân gây bệnh để từ
đó có những định hƣớng đúng đắn trong việc phòng trừ bệnh, nhằm làm giảm thiệt
hại và mang lại hiệu quả cho ngƣời sản xuất.
Đƣợc sự chấp thuận của bộ Môn Công nghệ Sinh học Trƣờng Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, dƣới sự hƣớng dẫn của KS. Dƣơng Thành Lam và TS.
Lê Đình Đôn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phát hiện nấm Fusarium spp. gây bệnh
thối xƣơng rồng (Cactaceae) bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)”.

2
1.2. Mục đích - yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xác định tên loài Fusarium spp. gây bệnh thối xƣơng rồng nhằm tìm ra quy
trình phòng trừ hữu hiệu cho xƣơng rồng.
1.2.2. Yêu cầu
 Điều tra tình hình bệnh hại tại các vƣờn trồng xƣơng rồng trên địa bàn Tp.
Hồ Chí Minh.
 Thu thập và phân lập mẫu nấm trên xƣơng rồng bệnh. Nhân sinh khối các
dòng nấm Fusarium spp.
 Ly trích DNA các dòng nấm phân lập đƣợc. Thiết lập quy trình phản ứng
PCR để khảo sát các yếu tố nhƣ chu kì nhiệt, nồng độ primer, nồng độ DNA, số chu
kì thích hợp.
 Giải trình tự sản phẩm PCR.
 Chủng bệnh trên xƣơng rồng khỏe.
1.3 Giới hạn của đề tài
 Đề tài đƣợc thực hiện từ 20/03/2007 đến 30/07/2007.
 Chỉ thực hiện đƣợc trên một số mẫu.

3


Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Một số đặc tính để phát triển xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004)
Trƣớc đây không chỉ ở nƣớc ta mà nhiều nƣớc trên thế giới cũng vậy, số
ngƣời thích chơi kiểng xƣơng rồng rất ít. Ngƣời nào thích “sƣu tập” thì số lƣợng
cũng không nhiều.
Nhƣng, càng về sau, số nghệ nhân đến với kiểng xƣơng rồng càng ngày càng
nhiều, khi họ nhận ra một điều loại kiểng trụi lá này đƣợc các nhà thực vật học
không ngừng lai tạo thêm nhiều cây có hình dáng lạ, và màu sắc cũng khác lạ.
Xƣơng rồng có đủ loại: cây cao có mà cây thấp cũng có, cây to cây nhỏ
cũng nhiều.
Theo thói quen, hễ nói đến cây kiểng, ai cũng nghĩ là trồng ở trong vƣờn,
ngoài sân, trƣớc hàng ba, lan can… nơi có nhiều nắng gió thông thoáng, chứ không
ai nghĩ kiểng lại đem chƣng bày trong nhà, nơi thiếu ánh nắng và không khí lúc nào
cũng hầm hập.
Với xƣơng rồng là loại cây kì diệu, có thể sống tƣơi tốt trong nhà một vài
tuần, thậm chí cả tháng, trong điều kiện thiếu hẳn ánh nắng, thiếu bón tƣơi… chính
sự kì diệu này đã đƣa kiểng xƣơng rồng đến với mọi ngƣời, mọi nhà, trong đó có
đông đủ cƣ dân thành thị.
Đƣợc biết, tại nhiều nƣớc Âu Mỹ, mãi đến những năm đầu thế kỷ XX, ngƣời
ta mới khám phá ra đƣợc điều này. Bởi vì trong giai đoạn này các thành phố của họ
mật độ thị dân tăng cao đột ngột. Từ đó, đƣờng sá đƣợc mở rộng thêm, nhà cửa
đƣợc cao tầng hơn, đất thổ cƣ trong thành phố còn lại bao nhiêu điều đƣợc trƣng
dụng vào việc cất thêm nhà cửa…. Nhƣ vậy, không ai còn một khoảng đất thừa nào
để trồng cây cảnh nhƣ trƣớc đây nữa!

Xem chi tiết: Phát hiện loài Fusarium spp. Gây bệnh thối xương rồng (Cactaceae) bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction